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实验试剂：琼脂糖（Promega公司，V3125）；其他常备试剂购自sigma公司；PKC活性检测试剂盒（Promega公司， V5330）
实验仪器：电泳仪（北京六一厂，112-0640）；水平电泳槽（北京六一厂，122-3146）；电热恒温培养箱（碧云天生物，EBI025）；电热恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8）
基本原理：分离PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性（PKC活化度）。
实验仪器：电泳仪（北京六一厂，112-0640）；水平电泳槽（北京六一厂，122-3146）；电热恒温培养箱（碧云天生物，EBI025）；电热恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8）
基本原理：分离PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性（PKC活化度）。
操作步骤：
1．用预冷的匀浆器把细胞匀浆。
2．在4℃，用14,000 × g 离心裂解液5 分钟，保存上清。
3．用PKC 抽提液预平衡1ml 的DEAE 纤维素柱，再把第2 步中得到的上清过柱。用5ml的PKC 抽提液洗柱子，然后用5ml 含有200mM NaCl 的PKC 抽提液洗脱含有PKC 的组分。
4．用PKC 稀释液（PKC dilution buffer）将少量蛋白激酶C（Promtein Kinase C）稀释到2.5ug/ml。随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。
5．用探头超声波破碎仪超声处理PKC Activator Solution 20-30 秒，或直到溶液变温暖。
6．对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml 小离心管中混合PepTag® PKC 5× Buffer,PepTag® C1 Peptide，超声过的PKC Activator 5X Solution，和水。在样品加入之前，小离心管一直要放在冰上。阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值（说明书第IV.部分）。
标准PKC检测
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ul
PKC Activator 5X Solution, 超声处理的 5ul
短肽保护液（非必须） 1ul
样品 9ul
去离子水使终体积为 25ul
PKC阳性对照检测
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ul
PKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul
短肽保护液（非必须） 1ul
Protein Kinase C (2.5ug/ml 溶于 PKC dilution buffer） 4ul
去离子水使终体积为 25ul
PKC阴性对照检测（不加PKC）
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ul
PKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul
短肽保护液（非必须） 1ul
去离子水使终体积为 25ul
7．在0 时间点，把一支管子从冰上移到30℃水浴中孵育2 分钟。然后加入样品或蛋白激酶C 在30℃ 再孵育30 分钟。
8．把管子放进开水浴或95℃ 加热块10 分钟以终止反应。在凝胶电泳前把样品一直避光存放在4℃ 或-20℃。
9．把样品上样到胶上之前，往每个样品中加进1ul 的80％甘油，以确保样品保留在上样孔中（说明书第III.F 部分）。
10．每孔点样10ul，在0.8% 琼脂糖凝胶上以100V电泳15分钟分开样品，拍照。
检测结果：
说明：后面2组泳道“阳性(PC)”和“阴性(NC)”为试剂盒自带系统对照。
注：阳性条带以Gel pro4 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integrated optical density）累积光密度参考值。按照百分比例计算PKC活性百分比
（以阳性对照IOD值为100，其余各组的PKC+ p-PKC总和为100分配IOD数值）
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Lanes:
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Lane 1
|
Lane 2
|
Lane 3
|
Lane 4
|
Lane 5
|
Lane 6
|
Lane PC
|
|
Rows
|
( % )
|
( % )
|
( % )
|
( % )
|
( % )
|
( % )
|
( % )
|
|
PKC
|
77.082
|
75.616
|
88.98
|
66.975
|
77.93
|
74.645
|
100
|
|
p-PKC
|
22.918
|
24.384
|
11.02
|
33.025
|
22.07
|
25.355
|
0
|
|
Sum
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100
|
100
|
100
|
100
|
100
|
100
|
100
|
|
p-PKC:PKC
|
0.29732
|
0.322471
|
0.123848
|
0.493094
|
0.283203
|
0.339674
|
0
|
|
样本
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#1
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#2
|
#3
|
#4
|
#5
|
#6
|
PC
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实验咨询：service@jiamay.com
嘉美生物是一家主要从事Annexin V,信号转导抗体,重组人和动物蛋白,磷酸化抗体,各种动物ELISA试剂盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司。
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