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WB,IH,IF,ICC实验外包服务
【嘉美生物】即日起推出WB, IH, ICC, IF实验服务优惠活动，细则如下：
1、嘉美生物提供原装进口抗体。
我实验室进行实验服务有若干年的历史，因此我们实验室存有大批的国外原装抗体；意味着实验者不必要花更多的钱去购买国外昂贵（一般都会需要2000元以上）的一抗。
2、嘉美生物免费提供二抗以及所有的与实验相关的后续试剂。
3、嘉美生物免费提供WB标本所需要的蛋白保护液。
该蛋白保护液可以保护样品在4度下保存半个月而不至于蛋白有损失。
4、实验委托者之需要提供样品，即可完成整个实验。
WB实验服务案例
注：SDS-PAGE凝胶浓度为12%；
阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integrated optical density）累积光密度参考值。
Fig 1：
WB操作规程
一．设备和试剂
1．设备
① 电泳电源
Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)
② 电泳仪及附件
Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)
③ 电转仪及附件
Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170- 3930)
④ NC膜
PIERCE，Catalog#88018
⑤ 滤纸
Whatman,3MM CHR
2.试剂
① 凝胶试剂（实验室常备）
②Total protein Extraction Kit ，ProMab•美国，Cat. No：SJ-200501
Renewable Buffer膜再生液，ProMab•美国，Cat. No：SJ-200512
天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract™ (M-PEK)，MERCK•德国，Cat. No： 444810
天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBuster TM Protein Exaction Kit ，MERCK•德国，Cat. No：71183-3
Bradford蛋白浓度测定试剂盒，嘉美生物•中国，Cat. No：BRAKIT
细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒，嘉美生物•中国，Cat. No：P1001
细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒，嘉美生物•中国，Cat. No：P1003
③ 常用溶液及缓冲液
A．5%积层胶所用溶液
按总体积2.5ml：
ddH2O：1.7ml
30%丙烯酰胺溶液：0.42ml
1.0mol/L Tris (PH=6.8)：0.315ml
10%SDS：25ul
10%过硫酸铵：25ul
TEMED：3ul
B．分离胶溶液配方参考表
C．电泳缓冲液，1L
3g Tris-base、14.4g 甘氨酸、1g SDS，加蒸馏水至IL，pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液，在室温下长期保存。
D．电泳转移缓冲液,1L
3g Tris-base、14.4g 甘氨酸、甲醇200ml, 加蒸馏水至1L, 也可以制成10×的储存液，在湿温下长期保存。
E．5×样品缓冲液,10ml
0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（Ph6.8）、5ml 50%的甘油、2ml 10%的SDS、0.5ml 2-巯基乙醇、1ml 1%溴酚蓝，0.9ml的蒸馏水，可在4℃保存数周，或在-20℃保存数月。
④ 二抗稀释液
用1%BSA-PBS（含0.05%TWEEN20）稀释。
常用Secondary Antibody ：
Rabbit Anti Goat IgG/HRP,嘉美生物, SEH0103,(1:10,000~40,000)
Goat Anti Rabbit IgG/HRP (SCBT, Catalog# sc-2030,1:10,000~40,000)
Goat Anti Mouse IgG+A+M(H+L)/HRP, ZYMED, #62-64201(1:40,000~100,000)
Goat anti-rat IgG-HRP,SANTA, sc-2032(1:5 000~1:10 000)
二．蛋白提取（根据样品及检测要求选取以下适当提取方法）
A-1．组织裂解提取总蛋白 (采用Total protein Extraction Kit，ProMab, Cat. No：SJ-200501 )
1)．用剪刀剪取约0.5mg组织，置于组织匀浆器中，加入1ml 总蛋白提取液，匀浆5min~20min直到组织充分破碎,然后冰上放置10~20min后，再匀浆5min~20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。
2)．超声3次，每次3s。
3)．9000rpm，离心10min，取适量上清置于新的1.5ml离心管中
4)．-20℃冻存。
A-2．组织裂解提取膜蛋白（采用天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract™ (M-PEK)，MERCK，Cat. No： 444810）
1)．确定缓冲液充分融解，且被旋涡器充分混合。在抽提过程中缓冲液1和 2 保持在冰上并和蛋白酶抑制剂混合。
2)．以下组织的处理应当尽快转移到 4℃无菌器皿中,如结缔组织,脂肪 血管等，最理想的组织应当切成2到3mm的碎块，然后转入一个装有2ml冰冷缓冲液的管中洗涤。
3)．轻轻弹打试管几次冲散血细胞和其它松散物质。
4)．组织碎块在100×g 4℃条件下离心2分钟，小心移去上清液且保证没有沉淀丢失。
5)．加入2毫升冰冷缓冲液洗涤，重复步骤3和4洗涤，在最后的洗涤步骤之后，小心完全地除去所有的缓冲液。
6)．转移适当量的细碎切块 (可能冰冻的) 到一个预冷的匀浆器。 (最好是一个玻璃或石英制品)，向匀浆器中加入10ul 蛋白酶抑制剂，并立即加入2毫升冷的缓冲液1 萃取组织块。
7)．小心地匀浆组织碎块，可以使用杵磨碎组织细块直到它们成为冰冷的混合体 (例如 牛的肝脏需要10 下) ，尽可能使碎块看不见。需要的用杵磨的次数取决于组织的结构。如果需要提高效率，可以事先使用显微镜观察其结构。目的是为了得到单个细胞，而非对组织进行支离破碎。
8)．尽可能完全地转移混合物到一支预冷的管中并在4℃ 轻柔的摇动10分钟。推荐使用旋转式振动器可以避免细胞结团的形成。
9)．在16,000 x g和4 ℃ 15 min条件下分离不能溶解的材料。
10)．丢弃上清液(丰富的“可溶性”蛋白质，此蛋白溶液可用于内参检测)或使用吸移管转移它到样品管，无需干扰底层细胞。切记分离所有液体。 如果需要应当保留成数份冰冻以便以后分析。
11)．放入5ul蛋白酶抑制剂到匀浆器中充分混匀,并立即加入1毫升冰冷缓冲液2萃取细胞团，使用吸移管仔细地完全地重悬细胞团。在30分钟 4 ℃条件下轻柔的摇动。 推荐一台旋转式振动器避免细胞团的形成。
12)．在16,000 x g和 4 ℃ 15 min条件下 分离不能溶解的材料。
13)．使用吸移管完全转移上层清液(包括丰富的膜相关蛋白质)到样品管，无需吸入细胞残渣。
A-3．组织裂解分离提取浆/核蛋白 (采用天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBuster TM Protein Exaction Kit ，MERCK，Cat. No：71183-3)
1)．使用前浆冷冻的Protease Inhibitor Coctail Set 1 溶于100ul 灭菌水配成100 ×体积，分装冻存于-20度(1~3×107细胞用1ul/100×)。
2)．所有蛋白体提取过程应在冰面上操作，保持蛋白的稳定性。
3)．取约1~20mg适量的冻存组织置于EP管中，加入液氮使用EP管研磨杵快速研磨成粉末。
4)．将适量粉末转移至预冷的1.5ml EP管中，加入150ul NucBuster Reagent 1。
5)．高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。
6)．4℃，16000g离心5min。
7)．移除上清液(为胞浆蛋白成分，可用于内参检测)，胞浆蛋白可以保存他用或者丢弃，再用500ul预冷的1×PBS再洗一次去除多余的胞浆蛋白。
8)．在絮状沉淀中加入
1ul 100×Protease Inhibitor Coctail
1ul 100mM DTT
75ul NucBuster Exaction Reagent 2
9)．高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。
10)．4℃，16000g离心5min。
11)．将上清液(核蛋白)转移至另一管，可立即使用或分装保存于-70℃。
B-1．细胞裂解提取总蛋白 (采用Total protein Extraction Kit，ProMab, Cat. No：SJ-200501 )
1)．细胞收集好，加入1ml 总蛋白提取液，充分吹打,然后冰上放置10~20minmin后，再吹5min~20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。
2)．超声3次，每次3s。
3)．9000rpm，离心10min，取适量上清置于新的1.5ml离心管中。
4)．-20℃冻存。
B-2．细胞裂解提取膜蛋白（采用天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract™ (M-PEK)，MERCK，Cat. No： 444810）
1)．确定缓冲液充分融解，且被旋涡器充分混合。在抽提过程中缓冲液1和 2 保持在冰上并和蛋白酶抑制剂混合。
2)．将细胞收集好转入一个装有2ml冰冷缓冲液的管中洗涤。
3)．轻轻弹打试管几次冲散血细胞和其它松散物质。
4)．在100×g 4℃条件下离心2分钟， 小心移去上清液且保证没有沉淀丢失。
5)．加入2毫升冰冷缓冲液洗涤，重复步骤3和4洗涤，在最后的洗涤步骤之后，小心完全地除去所有的缓冲液。
6)．向装有洗涤好的细胞的管中加入10ul 蛋白酶抑制剂，并立即加入2毫升冷的缓冲液1 萃取细胞。
7)．小心地吹打细胞，尽可能使细胞看不见。
8)．尽可能完全地转移混合物到一支预冷的管中并在 4 ℃ 轻柔的摇动10分钟。推荐使用旋转式振动器可以避免细胞结团的形成。
9)．在16,000 x g和 4 ℃ 15 min条件下分离不能溶解的材料。
10)．丢弃上清液(丰富的“可溶性”蛋白质，此蛋白溶液 可用于内参检测)或使用吸移管转移它到样品管，无需干扰底层细胞。切记分离所有液体。 如果需要应当保留成数份冰冻以便以后分析。
11)．放入5ul蛋白酶抑制剂到管中充分混匀，并立即加入1毫升冰冷缓冲液2萃取细胞团.，使用吸移管仔细地完全地重悬细胞团。在30分钟 4 ℃条件下轻柔的摇动。 推荐一台旋转式振动器避免细胞团的形成。
12)．在16,000 x g和 4℃ 15 min条件下 分离不能溶解的材料。
13)．使用吸移管完全转移上层清液(包括丰富的膜相关蛋白质)到样品管，无需吸入细胞残渣。
B-3．细胞裂解分离提取浆/核蛋白 (采用天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBuster TM Protein Exaction Kit ，MERCK，Cat. No：71183-3)
1)．使用前浆冷冻的Protease Inhibitor Coctail Set 1 溶于100ul 灭菌水配成100 ×体积，分装冻存于-20度(1~3×107细胞用1ul/100×)。
2)．所有蛋白体提取过程应在冰面上操作，保持蛋白的稳定性。
3)．将细胞收集好在EP管中，加入液氮使用EP管研磨杵快速研磨成粉末。
4)．将适量粉末转移至预冷的1.5ml EP管中，加入150ul NucBuster Reagent 1。
5)．高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。
6)．4℃，16000g离心5min。
7)．移除上清液(为胞浆蛋白成分，可用于内参检测)，胞浆蛋白可以保存他用或者丢弃，再用500ul预冷的1×PBS再洗一次去除多余的胞浆蛋白。
8)．在絮状沉淀中加入
1ul 100×Protease Inhibitor Coctail
1ul 100mM DTT
75ul NucBuster Exaction Reagent 2
9)．高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。
10)．4℃，16000g离心5min。
11)．将上清液(核蛋白)转移至另一管，可立即使用或分装保存于-70℃。
线粒体蛋白提取见附录1
三．蛋白浓度测定：由于采用内参照法校正，省略根据总蛋白浓度估算点样法。
四．SDS-PAGE电泳
1)．将抗原（组织/细胞裂解液）样品体积：5×loading buffer体积=5：1，混匀，在100℃加热三分钟以使蛋白质变性。
2)．设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样。一般每个电泳道加样最大体积为25µl,每个电泳道上样的最低蛋白质量（每一条蛋白质条带）：0.1µg（考马斯亮蓝染色）-2ng（银染色）,最高蛋白质量（蛋白质混合物）：20-40µg。
3)．把电泳装置与电源连接好，将电压调至200V，电流应流向阳极，待溴酚蓝迁移到分离胶底部0.5cm处，关闭电源。
4)．从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用去离子水冲洗干净。准备进行免疫印操作。
五．免疫印迹操作-转膜
1)．将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中，浸泡15-20min.。
2)．带上手套，裁剪好滤纸（Whatman,3MM CHR）和电转膜，滤纸和膜大小为83mm×75mm，尽量避免污染滤纸和膜，将裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，驱除留于膜上的气泡。
3)．打开转移盒并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移盒壁上，海绵上再放置一张浸湿的Whatman,3MM滤纸。
4)．小心将凝胶放置于滤纸上，避免气泡（用转移缓冲液润湿并戴手套以转移缓冲液润湿胶面，小心将电转膜放在胶面上，从凝胶的一边开始轻轻放下可避免气泡，注意一定要戴手套或镊子接触膜）。
5)．用去离子水清洗缓冲液槽，在缓冲液槽中放入搅拌子，将另一块海绵用转移缓冲液浸透后放在凝胶-膜“三明治”上，关上转移盒并插入转移槽。
6)．将冰盒装入缓冲液槽，注满4℃预冷的转移缓冲液。
7)．将整个装置放在磁力搅拌器上并开始搅拌，连接好转移电极恒流300mA转移70min。
8)．电转完毕后，将电转膜置于5%的脱脂奶粉（PBS配制）中封闭，37℃2小时或4℃过夜。
六．免疫检测
一抗与靶蛋白的结合
1)．封闭的膜用PBST漂洗2-3次。
2)．将加样槽洗涤干净，用蒸馏水润洗，晾干，将膜用一次性手套覆盖好，按标记和实验设计切下膜条（一般为3 mm宽左右）按顺序置于加样槽中，作好实验记录，加入相应的一抗约1ml，注意保证膜的所有部分同溶液接触。
3)．室温下于摇床孵育2h或4℃过夜。
4)．弃去一抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加2-3 mlPBST，上摇床洗涤洗涤5-10min ，换液，反复4次。
酶标记二抗与一抗的结合
1)．根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度（用含0.5%脱脂奶粉的PBS稀释），每个加样槽中加入二抗1ml左右室温下于摇床孵育1h或4℃过夜，注意保证膜的所有部分同溶液接触。
2)．弃去二抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加2-3 mlPBST，上摇床洗涤洗涤5-10min ，换液，反复4次。
七．化学发光
将膜风干，贴在玻璃纸上，加底物，做化学发光，得到胶片。将背景较高的底片片放入PIERCE公司X光片背景去除液中，观察到理想的结果时，终止反应，用水清洗以去除不需要的背景。
八．根据实验要求可适当选择Werstern Bolt 膜再生显色法（采用Renewable Buffer膜再生液，ProMab，Cat. No：SJ-200512）
1)．在完成WB的显色或化学发光检测后，将蛋白转印膜置1×PBS中漂洗5分钟。
2)．弃去1×PBS，加入适量的WB膜再生液，至少需把膜完全覆盖。在摇床上漂洗45min。
3)．弃WB膜再生液，加入1×PBS在摇床上漂洗5min后，弃去1×PBS，重复3次洗涤步骤。
4)．进行封闭等WB的后续操作。
附录1：
细胞线粒体分离实验步骤
实验试剂：嘉美生物细胞线粒体分离试剂盒 产品编号：P1004
试剂盒组成：
实验步骤：
1)．收集约1×106--107细胞（贴壁细胞用PBS洗一遍，胰酶消化后离心，悬浮细胞直接离心）；
2)．洗涤细胞：用预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞2000rpm，4°C离心5min，弃上清。
3)．预处理：加入1-2.5ml临用前添加了PMSF的线粒体分离试剂至细胞中，轻轻悬浮细胞，冰浴放置10—15min。
4)．把细胞悬液转移到玻璃匀浆中，匀浆20下左右，把细胞匀浆2000rpm，4°C离心10min。
5)．小心把上清转移到另一离心管中，12000rpm，4°C离心10min。
6)．小心去除上清，沉淀即为分离得到的细胞线粒体。
7)．在分离得到的线粒体样品中加入150—200ul临用前添加了PMSF的线粒体裂解液裂解线粒体，裂解后的线粒体可以用于PAGE、Western、IP及线粒体中的酶活性检测。
1、嘉美生物提供原装进口抗体。
我实验室进行实验服务有若干年的历史，因此我们实验室存有大批的国外原装抗体；意味着实验者不必要花更多的钱去购买国外昂贵（一般都会需要2000元以上）的一抗。
2、嘉美生物免费提供二抗以及所有的与实验相关的后续试剂。
3、嘉美生物免费提供WB标本所需要的蛋白保护液。
该蛋白保护液可以保护样品在4度下保存半个月而不至于蛋白有损失。
4、实验委托者之需要提供样品，即可完成整个实验。
WB实验服务案例
| 一抗 | 目的蛋白分子量 | 稀释度 | 公司/货号 | 二抗 | 稀释度 |
| Goat Rock1 antibody | about 160 kD | 1:500 | SANTA，SC-6055 | Rabbit Anti Goat IgG/HRP | 1:40,000 |
| Goat Rock2 antibody | about 160 kD | 1:500 | SANTA，SC-1851 | Rabbit Anti Goat IgG/HRP | 1:40,000 |
| Mouse GAPDH antibody | about 37 kD | 1:800 | SANTA,SC-365062 | Goat Anti mouse IgG/HRP | 1:80,000 |
注：SDS-PAGE凝胶浓度为12%；
阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integrated optical density）累积光密度参考值。
Fig 1：
| Lanes: | Lane 1 | Lane 2 | Lane 3 | Lane 4 | Lane 5 | Lane 6 |
| Rows | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) |
| Rock1 | 242.39 | 337.97 | 229.78 | 233.16 | 151.48 | 205.53 |
| Rock2 | 233.48 | 219.11 | 238.76 | 191.61 | 151.18 | 203.66 |
| GAPDH | 160.18 | 130.47 | 141.06 | 156.13 | 147.77 | 151.07 |
| 样本编号 | 25 | 38 | 28 | 23 | 26 | 24 |
WB操作规程
一．设备和试剂
1．设备
① 电泳电源
Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)
② 电泳仪及附件
Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)
③ 电转仪及附件
Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170- 3930)
④ NC膜
PIERCE，Catalog#88018
⑤ 滤纸
Whatman,3MM CHR
2.试剂
① 凝胶试剂（实验室常备）
| 试剂名称 | 厂家 |
| 30%丙烯酰胺溶液 | SIGMA |
| Tris-base | SIGMA |
| 10%SDS | SIGMA |
| 10%过硫酸铵 | SIGMA |
| TEMED | SIGMA |
②Total protein Extraction Kit ，ProMab•美国，Cat. No：SJ-200501
Renewable Buffer膜再生液，ProMab•美国，Cat. No：SJ-200512
天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract™ (M-PEK)，MERCK•德国，Cat. No： 444810
天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBuster TM Protein Exaction Kit ，MERCK•德国，Cat. No：71183-3
Bradford蛋白浓度测定试剂盒，嘉美生物•中国，Cat. No：BRAKIT
细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒，嘉美生物•中国，Cat. No：P1001
细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒，嘉美生物•中国，Cat. No：P1003
③ 常用溶液及缓冲液
A．5%积层胶所用溶液
按总体积2.5ml：
ddH2O：1.7ml
30%丙烯酰胺溶液：0.42ml
1.0mol/L Tris (PH=6.8)：0.315ml
10%SDS：25ul
10%过硫酸铵：25ul
TEMED：3ul
B．分离胶溶液配方参考表
3g Tris-base、14.4g 甘氨酸、1g SDS，加蒸馏水至IL，pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液，在室温下长期保存。
D．电泳转移缓冲液,1L
3g Tris-base、14.4g 甘氨酸、甲醇200ml, 加蒸馏水至1L, 也可以制成10×的储存液，在湿温下长期保存。
E．5×样品缓冲液,10ml
0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（Ph6.8）、5ml 50%的甘油、2ml 10%的SDS、0.5ml 2-巯基乙醇、1ml 1%溴酚蓝，0.9ml的蒸馏水，可在4℃保存数周，或在-20℃保存数月。
④ 二抗稀释液
用1%BSA-PBS（含0.05%TWEEN20）稀释。
常用Secondary Antibody ：
Rabbit Anti Goat IgG/HRP,嘉美生物, SEH0103,(1:10,000~40,000)
Goat Anti Rabbit IgG/HRP (SCBT, Catalog# sc-2030,1:10,000~40,000)
Goat Anti Mouse IgG+A+M(H+L)/HRP, ZYMED, #62-64201(1:40,000~100,000)
Goat anti-rat IgG-HRP,SANTA, sc-2032(1:5 000~1:10 000)
二．蛋白提取（根据样品及检测要求选取以下适当提取方法）
A-1．组织裂解提取总蛋白 (采用Total protein Extraction Kit，ProMab, Cat. No：SJ-200501 )
1)．用剪刀剪取约0.5mg组织，置于组织匀浆器中，加入1ml 总蛋白提取液，匀浆5min~20min直到组织充分破碎,然后冰上放置10~20min后，再匀浆5min~20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。
2)．超声3次，每次3s。
3)．9000rpm，离心10min，取适量上清置于新的1.5ml离心管中
4)．-20℃冻存。
A-2．组织裂解提取膜蛋白（采用天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract™ (M-PEK)，MERCK，Cat. No： 444810）
1)．确定缓冲液充分融解，且被旋涡器充分混合。在抽提过程中缓冲液1和 2 保持在冰上并和蛋白酶抑制剂混合。
2)．以下组织的处理应当尽快转移到 4℃无菌器皿中,如结缔组织,脂肪 血管等，最理想的组织应当切成2到3mm的碎块，然后转入一个装有2ml冰冷缓冲液的管中洗涤。
3)．轻轻弹打试管几次冲散血细胞和其它松散物质。
4)．组织碎块在100×g 4℃条件下离心2分钟，小心移去上清液且保证没有沉淀丢失。
5)．加入2毫升冰冷缓冲液洗涤，重复步骤3和4洗涤，在最后的洗涤步骤之后，小心完全地除去所有的缓冲液。
6)．转移适当量的细碎切块 (可能冰冻的) 到一个预冷的匀浆器。 (最好是一个玻璃或石英制品)，向匀浆器中加入10ul 蛋白酶抑制剂，并立即加入2毫升冷的缓冲液1 萃取组织块。
7)．小心地匀浆组织碎块，可以使用杵磨碎组织细块直到它们成为冰冷的混合体 (例如 牛的肝脏需要10 下) ，尽可能使碎块看不见。需要的用杵磨的次数取决于组织的结构。如果需要提高效率，可以事先使用显微镜观察其结构。目的是为了得到单个细胞，而非对组织进行支离破碎。
8)．尽可能完全地转移混合物到一支预冷的管中并在4℃ 轻柔的摇动10分钟。推荐使用旋转式振动器可以避免细胞结团的形成。
9)．在16,000 x g和4 ℃ 15 min条件下分离不能溶解的材料。
10)．丢弃上清液(丰富的“可溶性”蛋白质，此蛋白溶液可用于内参检测)或使用吸移管转移它到样品管，无需干扰底层细胞。切记分离所有液体。 如果需要应当保留成数份冰冻以便以后分析。
11)．放入5ul蛋白酶抑制剂到匀浆器中充分混匀,并立即加入1毫升冰冷缓冲液2萃取细胞团，使用吸移管仔细地完全地重悬细胞团。在30分钟 4 ℃条件下轻柔的摇动。 推荐一台旋转式振动器避免细胞团的形成。
12)．在16,000 x g和 4 ℃ 15 min条件下 分离不能溶解的材料。
13)．使用吸移管完全转移上层清液(包括丰富的膜相关蛋白质)到样品管，无需吸入细胞残渣。
A-3．组织裂解分离提取浆/核蛋白 (采用天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBuster TM Protein Exaction Kit ，MERCK，Cat. No：71183-3)
1)．使用前浆冷冻的Protease Inhibitor Coctail Set 1 溶于100ul 灭菌水配成100 ×体积，分装冻存于-20度(1~3×107细胞用1ul/100×)。
2)．所有蛋白体提取过程应在冰面上操作，保持蛋白的稳定性。
3)．取约1~20mg适量的冻存组织置于EP管中，加入液氮使用EP管研磨杵快速研磨成粉末。
4)．将适量粉末转移至预冷的1.5ml EP管中，加入150ul NucBuster Reagent 1。
5)．高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。
6)．4℃，16000g离心5min。
7)．移除上清液(为胞浆蛋白成分，可用于内参检测)，胞浆蛋白可以保存他用或者丢弃，再用500ul预冷的1×PBS再洗一次去除多余的胞浆蛋白。
8)．在絮状沉淀中加入
1ul 100×Protease Inhibitor Coctail
1ul 100mM DTT
75ul NucBuster Exaction Reagent 2
9)．高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。
10)．4℃，16000g离心5min。
11)．将上清液(核蛋白)转移至另一管，可立即使用或分装保存于-70℃。
B-1．细胞裂解提取总蛋白 (采用Total protein Extraction Kit，ProMab, Cat. No：SJ-200501 )
1)．细胞收集好，加入1ml 总蛋白提取液，充分吹打,然后冰上放置10~20minmin后，再吹5min~20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。
2)．超声3次，每次3s。
3)．9000rpm，离心10min，取适量上清置于新的1.5ml离心管中。
4)．-20℃冻存。
B-2．细胞裂解提取膜蛋白（采用天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract™ (M-PEK)，MERCK，Cat. No： 444810）
1)．确定缓冲液充分融解，且被旋涡器充分混合。在抽提过程中缓冲液1和 2 保持在冰上并和蛋白酶抑制剂混合。
2)．将细胞收集好转入一个装有2ml冰冷缓冲液的管中洗涤。
3)．轻轻弹打试管几次冲散血细胞和其它松散物质。
4)．在100×g 4℃条件下离心2分钟， 小心移去上清液且保证没有沉淀丢失。
5)．加入2毫升冰冷缓冲液洗涤，重复步骤3和4洗涤，在最后的洗涤步骤之后，小心完全地除去所有的缓冲液。
6)．向装有洗涤好的细胞的管中加入10ul 蛋白酶抑制剂，并立即加入2毫升冷的缓冲液1 萃取细胞。
7)．小心地吹打细胞，尽可能使细胞看不见。
8)．尽可能完全地转移混合物到一支预冷的管中并在 4 ℃ 轻柔的摇动10分钟。推荐使用旋转式振动器可以避免细胞结团的形成。
9)．在16,000 x g和 4 ℃ 15 min条件下分离不能溶解的材料。
10)．丢弃上清液(丰富的“可溶性”蛋白质，此蛋白溶液 可用于内参检测)或使用吸移管转移它到样品管，无需干扰底层细胞。切记分离所有液体。 如果需要应当保留成数份冰冻以便以后分析。
11)．放入5ul蛋白酶抑制剂到管中充分混匀，并立即加入1毫升冰冷缓冲液2萃取细胞团.，使用吸移管仔细地完全地重悬细胞团。在30分钟 4 ℃条件下轻柔的摇动。 推荐一台旋转式振动器避免细胞团的形成。
12)．在16,000 x g和 4℃ 15 min条件下 分离不能溶解的材料。
13)．使用吸移管完全转移上层清液(包括丰富的膜相关蛋白质)到样品管，无需吸入细胞残渣。
B-3．细胞裂解分离提取浆/核蛋白 (采用天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBuster TM Protein Exaction Kit ，MERCK，Cat. No：71183-3)
1)．使用前浆冷冻的Protease Inhibitor Coctail Set 1 溶于100ul 灭菌水配成100 ×体积，分装冻存于-20度(1~3×107细胞用1ul/100×)。
2)．所有蛋白体提取过程应在冰面上操作，保持蛋白的稳定性。
3)．将细胞收集好在EP管中，加入液氮使用EP管研磨杵快速研磨成粉末。
4)．将适量粉末转移至预冷的1.5ml EP管中，加入150ul NucBuster Reagent 1。
5)．高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。
6)．4℃，16000g离心5min。
7)．移除上清液(为胞浆蛋白成分，可用于内参检测)，胞浆蛋白可以保存他用或者丢弃，再用500ul预冷的1×PBS再洗一次去除多余的胞浆蛋白。
8)．在絮状沉淀中加入
1ul 100×Protease Inhibitor Coctail
1ul 100mM DTT
75ul NucBuster Exaction Reagent 2
9)．高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。
10)．4℃，16000g离心5min。
11)．将上清液(核蛋白)转移至另一管，可立即使用或分装保存于-70℃。
线粒体蛋白提取见附录1
三．蛋白浓度测定：由于采用内参照法校正，省略根据总蛋白浓度估算点样法。
四．SDS-PAGE电泳
1)．将抗原（组织/细胞裂解液）样品体积：5×loading buffer体积=5：1，混匀，在100℃加热三分钟以使蛋白质变性。
2)．设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样。一般每个电泳道加样最大体积为25µl,每个电泳道上样的最低蛋白质量（每一条蛋白质条带）：0.1µg（考马斯亮蓝染色）-2ng（银染色）,最高蛋白质量（蛋白质混合物）：20-40µg。
3)．把电泳装置与电源连接好，将电压调至200V，电流应流向阳极，待溴酚蓝迁移到分离胶底部0.5cm处，关闭电源。
4)．从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用去离子水冲洗干净。准备进行免疫印操作。
五．免疫印迹操作-转膜
1)．将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中，浸泡15-20min.。
2)．带上手套，裁剪好滤纸（Whatman,3MM CHR）和电转膜，滤纸和膜大小为83mm×75mm，尽量避免污染滤纸和膜，将裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，驱除留于膜上的气泡。
3)．打开转移盒并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移盒壁上，海绵上再放置一张浸湿的Whatman,3MM滤纸。
4)．小心将凝胶放置于滤纸上，避免气泡（用转移缓冲液润湿并戴手套以转移缓冲液润湿胶面，小心将电转膜放在胶面上，从凝胶的一边开始轻轻放下可避免气泡，注意一定要戴手套或镊子接触膜）。
5)．用去离子水清洗缓冲液槽，在缓冲液槽中放入搅拌子，将另一块海绵用转移缓冲液浸透后放在凝胶-膜“三明治”上，关上转移盒并插入转移槽。
6)．将冰盒装入缓冲液槽，注满4℃预冷的转移缓冲液。
7)．将整个装置放在磁力搅拌器上并开始搅拌，连接好转移电极恒流300mA转移70min。
8)．电转完毕后，将电转膜置于5%的脱脂奶粉（PBS配制）中封闭，37℃2小时或4℃过夜。
六．免疫检测
一抗与靶蛋白的结合
1)．封闭的膜用PBST漂洗2-3次。
2)．将加样槽洗涤干净，用蒸馏水润洗，晾干，将膜用一次性手套覆盖好，按标记和实验设计切下膜条（一般为3 mm宽左右）按顺序置于加样槽中，作好实验记录，加入相应的一抗约1ml，注意保证膜的所有部分同溶液接触。
3)．室温下于摇床孵育2h或4℃过夜。
4)．弃去一抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加2-3 mlPBST，上摇床洗涤洗涤5-10min ，换液，反复4次。
酶标记二抗与一抗的结合
1)．根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度（用含0.5%脱脂奶粉的PBS稀释），每个加样槽中加入二抗1ml左右室温下于摇床孵育1h或4℃过夜，注意保证膜的所有部分同溶液接触。
2)．弃去二抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加2-3 mlPBST，上摇床洗涤洗涤5-10min ，换液，反复4次。
七．化学发光
将膜风干，贴在玻璃纸上，加底物，做化学发光，得到胶片。将背景较高的底片片放入PIERCE公司X光片背景去除液中，观察到理想的结果时，终止反应，用水清洗以去除不需要的背景。
八．根据实验要求可适当选择Werstern Bolt 膜再生显色法（采用Renewable Buffer膜再生液，ProMab，Cat. No：SJ-200512）
1)．在完成WB的显色或化学发光检测后，将蛋白转印膜置1×PBS中漂洗5分钟。
2)．弃去1×PBS，加入适量的WB膜再生液，至少需把膜完全覆盖。在摇床上漂洗45min。
3)．弃WB膜再生液，加入1×PBS在摇床上漂洗5min后，弃去1×PBS，重复3次洗涤步骤。
4)．进行封闭等WB的后续操作。
附录1：
细胞线粒体分离实验步骤
实验试剂：嘉美生物细胞线粒体分离试剂盒 产品编号：P1004
试剂盒组成：
| 目录号 | 品名 | 规格 |
| P1004-1 | 线粒体分离试剂 | 125ml |
| P1004-2 | 台盼蓝染色液 | 10ml |
| P1004-3 | 线粒体储存液 | 15ml |
| P1004-4 | 线粒体裂解液 | 15ml |
| P1004-5 | PMSF(晶体) | 可配制1.5ml 100mM PMSF |
| P1004-6 | PMSF(溶剂) | 1.5ml |
实验步骤：
1)．收集约1×106--107细胞（贴壁细胞用PBS洗一遍，胰酶消化后离心，悬浮细胞直接离心）；
2)．洗涤细胞：用预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞2000rpm，4°C离心5min，弃上清。
3)．预处理：加入1-2.5ml临用前添加了PMSF的线粒体分离试剂至细胞中，轻轻悬浮细胞，冰浴放置10—15min。
4)．把细胞悬液转移到玻璃匀浆中，匀浆20下左右，把细胞匀浆2000rpm，4°C离心10min。
5)．小心把上清转移到另一离心管中，12000rpm，4°C离心10min。
6)．小心去除上清，沉淀即为分离得到的细胞线粒体。
7)．在分离得到的线粒体样品中加入150—200ul临用前添加了PMSF的线粒体裂解液裂解线粒体，裂解后的线粒体可以用于PAGE、Western、IP及线粒体中的酶活性检测。
