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大鼠心脏组织明胶酶谱MMP活性检测实验
实验仪器 泳电源Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)；电泳仪及附件Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)
实验标本 大鼠心脏组织20个
实验试剂
1、凝胶试剂：A．5%积层胶所用溶液
按总体积2.5ml：
ddH2O： 1.575ml
30%丙烯酰胺溶液： 0.42ml
1.0mol/L Tris (PH=6.8)： 0.315ml
10%SDS： 25ul
20substrate： 125ul
10%过硫酸铵： 25ul
TEMED： 3ul
B．8%分离胶溶液
按总体积10ml：
ddH2O： 4.1ml
30%丙烯酰胺溶液： 2.7ml
1.0mol/L Tris (PH=8.8)： 2.5ml
10%SDS： 100ul
20substrate： 500ul
10%过硫酸铵： 100ul
TEMED： 6ul
C．电泳缓冲液，1L
3g Tris-base、14.4g 甘氨酸、1g SDS，加蒸馏水至IL，pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液，在室温下长期保存。30%丙烯酰胺溶液；Tris-base（SIGMA）；10%SDS（SIGMA）；10%过硫酸铵；TEMED（sigma）
2、常用溶液及缓冲液：制备含MMP底物蛋白SDS-PAGE凝胶：采用8%分离胶。将20substrater融化，并90℃加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中加入20substrate并使之稀释20倍，混匀，然后再加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。
按总体积2.5ml：
ddH2O： 1.575ml
30%丙烯酰胺溶液： 0.42ml
1.0mol/L Tris (PH=6.8)： 0.315ml
10%SDS： 25ul
20substrate： 125ul
10%过硫酸铵： 25ul
TEMED： 3ul
B．8%分离胶溶液
按总体积10ml：
ddH2O： 4.1ml
30%丙烯酰胺溶液： 2.7ml
1.0mol/L Tris (PH=8.8)： 2.5ml
10%SDS： 100ul
20substrate： 500ul
10%过硫酸铵： 100ul
TEMED： 6ul
C．电泳缓冲液，1L
3g Tris-base、14.4g 甘氨酸、1g SDS，加蒸馏水至IL，pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液，在室温下长期保存。30%丙烯酰胺溶液；Tris-base（SIGMA）；10%SDS（SIGMA）；10%过硫酸铵；TEMED（sigma）
2、常用溶液及缓冲液：制备含MMP底物蛋白SDS-PAGE凝胶：采用8%分离胶。将20substrater融化，并90℃加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中加入20substrate并使之稀释20倍，混匀，然后再加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。
检测步骤
A、 阳性对照及待检测样品的前处理及上样 F、条带扫描 将凝胶放在扫描仪上扫描。用非透射光扫描，显示调整为灰度。并分析IOD值。72 kDa为MMP-2，92 kDa为MMP-9。
试剂盒组成与储存阳性对照：取5ul positive mixture与2XSDS-PAGE non-reducing buffer 等体积混合。待测样品5ul则1：1稀释于2XSDS-PAGE non-reducing buffer，混合后直接上样。不加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。每孔点样10ul。
B、电泳 30mA恒流电泳45min，溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
C、洗涤凝胶 驱除凝胶，去除压缩胶。放入容器中，先用适量蒸馏水冲洗凝胶。然后加入10ml 1Xbuffer A，室温漂洗凝胶2X15分钟。中间换液2次。
D、孵育 倒掉Buffer A。加入10ml 1Xbuffer B，室温孵育4小时。
E、显色 倒掉Buffer。加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液水平摇床上染色120min后，再采用脱色液（甲醇浓度为25% ,乙酸浓度为10 %）进行脱色60min。
试剂盒组成与储存阳性对照：取5ul positive mixture与2XSDS-PAGE non-reducing buffer 等体积混合。待测样品5ul则1：1稀释于2XSDS-PAGE non-reducing buffer，混合后直接上样。不加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。每孔点样10ul。
B、电泳 30mA恒流电泳45min，溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
C、洗涤凝胶 驱除凝胶，去除压缩胶。放入容器中，先用适量蒸馏水冲洗凝胶。然后加入10ml 1Xbuffer A，室温漂洗凝胶2X15分钟。中间换液2次。
D、孵育 倒掉Buffer A。加入10ml 1Xbuffer B，室温孵育4小时。
E、显色 倒掉Buffer。加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液水平摇床上染色120min后，再采用脱色液（甲醇浓度为25% ,乙酸浓度为10 %）进行脱色60min。
1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, −20 ℃
2. MMP-2 and MMP-9 positive mixture 500 µl, −20℃
3. 10 × Substrate G, 50 ml, −20℃
4. 10 × Buffer A, 50 ml, 4℃
5. 10 × Buffer B, 50 ml, 4℃
6. 10 × Mem-Gel Stain, 50 ml, 4℃
2. MMP-2 and MMP-9 positive mixture 500 µl, −20℃
3. 10 × Substrate G, 50 ml, −20℃
4. 10 × Buffer A, 50 ml, 4℃
5. 10 × Buffer B, 50 ml, 4℃
6. 10 × Mem-Gel Stain, 50 ml, 4℃
实验结果
注：阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integrated optical density）累积光密度参考值。(例如：1.33E+05=1.33×105)。 P: positive mixture 每孔点样蛋白约10ug
|
Lanes:
|
Lane1
|
Lane2
|
Lane3
|
Lane4
|
Lane5
|
Lane6
|
Lane7
|
Lane8
|
Lane9
|
LaneP
|
|
Rows
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
|
MMP-9
|
16200
|
20200
|
26700
|
33200
|
30474
|
43300
|
38600
|
35131
|
23500
|
60323
|
|
MMP-2
|
12535
|
101884
|
12974
|
12322.6
|
12170.2
|
11685
|
12481
|
9677.5
|
12522
|
16578
|
|
样本
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
P
|
|
Lanes:
|
Lane 1
|
Lane 2
|
Lane 3
|
Lane 4
|
Lane 5
|
Lane 6
|
Lane 7
|
Lane 8
|
Lane 9
|
Lane P
|
|
Rows
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
|
MMP-9
|
25390
|
25500
|
44900
|
42000
|
60300
|
43400
|
43100
|
36600
|
33400
|
67703
|
|
MMP-2
|
10120
|
12053
|
13797
|
15995
|
15138
|
13139
|
15800
|
12447
|
12514
|
14632
|
|
样本
|
10
|
11
|
12
|
13
|
14
|
15
|
16
|
17
|
18
|
P
|
|
Lanes:
|
Lane 1
|
Lane 2
|
Lane P
|
|
Rows
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
|
MMP-9
|
29000
|
66424
|
66935
|
|
MMP-2
|
3164.7
|
9350.6
|
13975
|
|
样本
|
19
|
20
|
P
|
实验咨询：service@jiamay.com
嘉美生物是一家主要从事Annexin V,信号转导抗体,重组人和动物蛋白,磷酸化抗体,各种动物ELISA试剂盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司。
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