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小鼠XX细胞药物干预后两种蛋白的磷酸化酪氨酸水平检测
实验分组：小鼠XX细胞，按下面分组进行药物干预培养，并收集细胞进行免疫沉淀实验。
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1
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正常对照组
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2
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高糖组
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3
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高糖+E药物
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4
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高糖+A药物(25μM)
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5
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高糖+A药物(50μM)
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6
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高糖+A药物(100μM)
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7
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高糖+A药物(100μM)+B药物（1mM）
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8
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高糖+C药物(25μM)
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9
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高糖+C药物(50μM)
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10
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高糖+C药物(100μM)
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11
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高糖+C药物(100μM)+B药物（1mM）
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12
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高糖+D药物(25μM)
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13
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高糖+D药物(50μM)
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14
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高糖+D药物(100μM)
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15
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高糖+D药物(100μM)+B药物（1mM）
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免疫沉淀过程
实验试剂：A抗体（santa cruz，IP浓度 1:100）；B抗体（santa cruz，IP浓度 1:100）；Protein A+G Agarose（嘉美生物）
蛋白样品的准备：1).对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。可以使用嘉美生物Western及IP细胞裂解液或各种RIPA裂解液等进行细胞的裂解。 2).对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。 3).对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。 注意事项：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
去除非特异性结合：1).取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。2).2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。注意事项：所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein A+G Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
免疫沉淀：采用A蛋白抗体，B蛋白抗体沉淀蛋白。1）.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。 2）.再加入20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein A+G Agarose的量调整为40微升。3）.2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A+G Agarose。4）.用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。 5）.完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。 6）.100℃或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品可测定浓度或者用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20℃保存。
蛋白样品的准备：1).对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。可以使用嘉美生物Western及IP细胞裂解液或各种RIPA裂解液等进行细胞的裂解。 2).对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。 3).对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。 注意事项：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
去除非特异性结合：1).取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。2).2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。注意事项：所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein A+G Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
免疫沉淀：采用A蛋白抗体，B蛋白抗体沉淀蛋白。1）.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。 2）.再加入20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein A+G Agarose的量调整为40微升。3）.2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A+G Agarose。4）.用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。 5）.完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。 6）.100℃或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品可测定浓度或者用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20℃保存。
Western blot检测
实验试剂：Phosphotyrosine抗体( Millipore, #05-321, 1:500)；Goat Anti Mouse IgG+A+M(H+L)/HRP(ZYMED, #62-64201,1:40,000-100,000)
实验设备：① 电泳电源：Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)；② 电泳仪及附件：Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)；③ 电转仪及附件：Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170- 3930)；④ NC膜：PIERCE，Catalog#88018；⑤ 滤纸：Whatman,3MM CHR
实验步骤：略
实验结果：目的蛋白检测，取以上沉淀下来蛋白混合液处理后，每孔点样15ul。
实验设备：① 电泳电源：Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)；② 电泳仪及附件：Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)；③ 电转仪及附件：Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170- 3930)；④ NC膜：PIERCE，Catalog#88018；⑤ 滤纸：Whatman,3MM CHR
实验步骤：略
实验结果：目的蛋白检测，取以上沉淀下来蛋白混合液处理后，每孔点样15ul。
注：SDS-PAGE凝胶浓度为12%；阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其（integrated optical density）累积光密度参考值。(例如：1.33E+05=1.33×105)。
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Lanes:
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Lane 1
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Lane 2
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Lane 3
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Lane 4
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Lane 5
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Lane 6
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Lane 7
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Rows
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(IOD)
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(IOD)
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(IOD)
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(IOD)
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(IOD)
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(IOD)
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(IOD)
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p-A蛋白
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19.415
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79.179
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81.869
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64.923
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64.544
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38.742
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76.364
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样本NO
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1
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2
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3
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4
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5
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6
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7
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Lanes:
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Lane 1
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Lane 2
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Lane 3
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Lane 4
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Lane 5
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Lane 6
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Lane 7
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Lane 8
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Rows
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(IOD)
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(IOD)
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(IOD)
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(IOD)
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(IOD)
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(IOD)
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(IOD)
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(IOD)
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p- A蛋白
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66.048
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38.485
|
24.444
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41.068
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50.312
|
57.092
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42.603
|
94.83
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|
样本NO
|
8
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9
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10
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11
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12
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13
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14
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15
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Lanes:
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Lane 1
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Lane 2
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Lane 3
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Lane 4
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Lane 5
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Lane 6
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Lane 7
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Rows
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(IOD)
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(IOD)
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(IOD)
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(IOD)
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(IOD)
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(IOD)
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(IOD)
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p- B蛋白
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19.37
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61.188
|
56.7
|
47.383
|
42.308
|
16.953
|
75.589
|
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样本NO
|
1
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2
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3
|
4
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5
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6
|
7
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Lanes:
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Lane 1
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Lane 2
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Lane 3
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Lane 4
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Lane 5
|
Lane 6
|
Lane 7
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Lane 8
|
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Rows
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(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
|
(IOD)
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p- B蛋白
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70.891
|
38.042
|
43.421
|
29.656
|
64.184
|
25.98
|
41.653
|
77.76
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样本NO
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8
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9
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10
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11
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12
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13
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14
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15
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实验咨询：service@jiamay.com
嘉美生物是一家主要从事Annexin V,信号转导抗体,重组人和动物蛋白,磷酸化抗体,各种动物ELISA试剂盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司。
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