一、测定原理

采用ABTS（2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt）评价样品抗氧化能力最初由Miller等（1993）提出，现采用的一般是后来Re等（1999）改进后的方法。该方法利用ABTS可被过硫酸钾、过氧化氢、二氧化锰等一系列化合物氧化，生成蓝绿色的ABTS+阳离子自由基，在734nm处有最大吸收峰。在抗氧化剂的作用下，ABTS+还原成无色的ABTS。通过测定734nm处的吸光值，即可判定反应物的抗氧化能力。

二、试剂组成

试剂一：ABTS试剂300μL × 1支

试剂二：液体试剂300μL × 1支

试剂三：1mM Trolox标准溶液1ml×1支（乙醇配制）

三、储存条件及有效期

试剂盒-20℃可保存6个月。

四、试剂的配制

ABTS应用液：将试剂二小心全部转入试剂一管内，旋好管盖，摇匀，室温放置12-16h，得到ABTS浓缩液。取10μLABTS浓缩液，采用稀释液（稀释液先采用纯水20×稀释）稀释至734nm处吸光度为0.65-0.75，记下稀释倍数（通常稀释倍数为50-200倍，可先从80-100倍区间内开始尝试。）将剩余浓缩液按稀释倍数稀释，得到ABTS应用液，避光存放。

Trolox标准溶液：如您需要将样品的ABTS自由基清除能力表示为Trolox当量（TEAC），则需要同步测定Trolox的ABTS清除能力；如您仅需要将结果表示为ABTS自由基清除率，则您可以忽略此步骤（可以不需要用到试剂三）。

五、操作步骤

	空白孔	测定孔	对照孔¹
ABTS应用液（μL）	200	200
样品溶液（μL）		20	20
稀释液（μL）²	20		200

充分混匀，室温避光静置30min³使之充分反应。734nm处采用酶标仪测定吸光值。

¹如样品颜色较浅可不做对照管（即认为对照为0）；

²稀释液即您配制样品的溶剂，一般为水、乙醇、PBS等；

²建议反应30min，数值更为准确，但一般快速测定时，反应10min即可（参考文献：）。

六、注意事项

1. 如样品中色素物质不是分析对象，建议先进行脱色处理，处理后样品可不做对照孔；

2. 如不确定样品的ABTS自由基清除能力，可先做不同浓度的稀释液进行摸索，并选择适宜浓度进行测定，高浓度下，浓度与清除率间并不线性相关。Trolox标准曲线绘制建议选取100-1000μM的浓度进行分析；

3. 混匀很重要，建议加样时反复吹打，加样结束后剧烈振摇酶标板30秒以上（液体不能溅出来）。